Postavená bola v prvej polovici 15. st. ako súčasť nových hradieb. Z vonkajšej strany boli tieto hradby chránené vodnou priekopou, ktorou tiekla časť Mlynského jarku. Vzhľadom na rozvoj bojovej techniky bola brána prebudovaná na ucelený bastión s mohutnou delostreleckou baštou s priestormi vyplnenými zeminou. Najrozsiahlejšia prestavba brány sa uskutočnila v r. 1808, kedy bol úplne zrušený jej obranný charakter. S oboma priľahlými časťami hradbového múru bola adaptovaná na účely novovzniknutej mestskej nemocnice. Poškodená bola aj nástenná maľba sv. Floriána. V roku 1915 bola táto maľba takmer úplne zničená a nahradená novou podobou svätca v prevedení prešovského maliara Maxa Kurtha. Sv. Floriána zobrazil v typickom ikonografickom stvárnení, teda s vojenskou prilbicou, s práporcom pri hasení požiaru, v pozadí so siluetami farského a františkánskeho kostola, ako aj budovou ev. kolégia. Poslednou rozsiahlou prestavbou Floriánovej brány v roku 1979 došlo k úprave valenej klenby priechodu, k zmenšeniu okien na východnej fasáde do pôvodných rozmerov a bola urobená renovácia celej výzdoby. V r. 1973 bola na západnej fasáde odhalená pamätná tabuľa, označujúca pôvodné miesto prešovskej mestskej hvezdárne zo 17. st.
