W pierwszej połowie XIV wieku w południowej części Preszowa wzniesiono budynek szpitala miejskiego, do którego jeszcze w tym samym stuleciu dobudowano mniejszą kaplicę. W 1429 roku w jej miejscu rozpoczęto budowę nowego kościoła szpitalnego pod wezwaniem Najświętszej Marii Panny. W jego sąsiedztwie znajdował się szpital i przytułek dla ubogich. Po nadejściu reformacji kościół przyszpitalny stał się dla słowackich mieszkańców Preszowa kościołem ewangelickim. Z rozkazu władcy Leopolda I Habsburga w 1673 roku kościół przekazano Zakonowi Braci Mniejszych, który w tym samym roku przybył do Preszowa. Oprócz kościoła zakonnicy otrzymali na własność także szpital. W XVII wieku połączono go z klasztorem, a w XVIII wieku przebudowano w stylu barokowym, nadając mu obecny kształt. W 1757 roku powstały cztery większe freski przedstawiające sceny z życia św. Jana Chrzciciela. Zachowały się one do dziś na sklepieniu nawy kościelnej. Do 1818 roku kościół należał do biskupstwa greckokatolickiego. W kaplicy północnej przed ołtarzem znajduje się sarkofag ze szczątkami biskupa Pawła Piotra Gojdiča. Jego szczątki złożono w katedrze po beatyfikacji w 2001 roku. Na północnej ścianie katedry, za szkłem, znajduje się kopia Całunu Turyńskiego, który katedra preszowska otrzymała w darze od Arcybiskupstwa Turyńskiego we Włoszech w 2003 roku. Kopia ta powstała w zaledwie czterech egzemplarzach. W latach 50. XX wieku, po likwidacji Kościoła Greckokatolickiego w Czechosłowacji, kościół został przekazany do używania Cerkwi Prawosławnej. Zwrócono go grekokatolikom w 1968 roku, po przywróceniu Kościoła Greckokatolickiego.
